AGROSLUŽBY OLOMOUC, s.r.o.AGROSLUŽBY OLOMOUC, s.r.o.

DETEKCE A STANOVENÍ PROGESTERONU V MLÉKU
LABORATORNÍ NÁVOD


ÚVOD

            Progesteron (4-pregnen-3,20-dion) (obr.1) je samičí pohlavní hormon, řadící se mezi tzv. gestageny – hormony žlutého tělíska (corpus luteum). Progesteron sice vzniká i v nadledvinách a varlatech, ale jeho hlavním producentem je v době mimo graviditu corpus luteum, které vzniká z ovulujícího folikulu po uvolnění vajíčka.

Obr. 1. Struktura přirozeně se vyskytujícího progesteronu v mléku.

 

         V tomto období hladina progesteronu v organismu výrazně roste. Progesteron připravuje placentu k nidaci vajíčka a udržuje ji v sekrečním stádiu. Pokud nedojde k oplození, corpus luteum zaniká a hladina hormonu tím pádem výrazně klesá (obr. 2). S další ovulací se cyklus opakuje.  Při úspěšném oplození přebírá, po 6 až 8 týdnech gravidity, funkci producenta progesteronu  placenta a hladina hormonu zůstává i nadále vysoká. Ten pak mechanizmem zpětné vazby blokuje uvolňování gonadotropních hormonů, čímž inhibuje dozrávání nového vajíčka a zabraňuje tak opětovnému oplodnění. Progesteron je stěžejním hormonem pro úspěšné oplodnění a udržení gravidity.


 


 

 

 

 

 



 

A                                                                                                                     B

Obr.č.2. Změny hladiny progesteronu v tělních tekutinách během estrálního cyklu(A) a březosti(B).

 Detekce a kvantifikace progesteronu AGROS ELISA kity

      Jedním z hlavních chovatelských problémů u hovězího dobytka je nesprávné určení doby říje a pozdní rozpoznání gravidity (tzn. efektivity inseminace). Z prováděných reprodukčních analýz vyplývá, že více než 20% inseminací je prováděno v nevhodnou dobu, čímž vzniká finanční ztráta za inseminační dávky a krmné dny do další říje. Navíc 20 až 25% říjí proběhne nezpozorováno (tzv. tiché říje), čímž dochází k dalším finančním ztrátám. Přesné určení říje je velmi důležité pro úspěšné provedení inseminace. Asi 10 až 12 hodin po skončení říje dochází k uvolnění vajíčka, které si udrží schopnost oplození asi 20 hodin. Transport životaschopných spermií do vejcovodu vyžaduje minimálně 6 hodin a počet spermií progresivně vzrůstá od 8. do 18. hodiny po inseminaci. Interval mezi říjemi (tzv. estrální cyklus) trvá u hovězího dobytka v průměru 21 dnů.

 V jeho průběhu dochází k charakteristickému vývoji hladiny progesteronu v organismu (obr.2). Po ovulaci se jeho produkce výrazně zvyšuje, v tomto období je jeho koncentrace v krevní plazmě přibližně 8 ng/ml, v mléce asi 12 ng/ml. Pokud nedojde k oplodnění, uvolní děloha okolo 17. dne po pravé říji prostaglandin, který způsobí regresi žlutého tělíska. Množství produkovaného progesteronu klesá a těsně před další říjí je jeho koncentrace opět takřka nulová a celý cyklus se opakuje. Při úspěšném oplození zůstává hladina hormonu trvale vysoká. Vzhledem k tomu, že koncentrace progesteronu se v organismu mění zcela charakteristicky a pravidelně, je možno z jejího stanovení poměrně  přesně určit v jaké fázi estrálního cyklu se organismus právě nachází. Opakované stanovení koncentrace po inseminaci je velmi dobře využitelné pro zjištění případné gravidity. Pravidelné krevní testy jsou u hovězího dobytka v podmínkách chovu jen těžko proveditelné a koncentrace progesteronu je navíc vyšší v mléce než v periferní plazmě. Z těchto důvodů je k diagnostickým účelům u skotu používáno stanovení progesteronu právě z mléka.

    V tomto článku Vás chceme informovat o tom, že pomocí AGROS ELISA imunotestů na bázi selektivních protilátek proti progesteronu je možné rychlé a specifické stanovení velmi nízkých hladin tohoto hormonu v mléce. Imunotesty založené na imunochemikáliích AGROS jsou rychlé, finančně nenáročné, přesné, specifické, citlivé a snadno proveditelné. Progesteron tak může být měřen v rozsahu 18pmol – 0,6 nmol/10 mL  (0.6 – 20 ng/ml) při použití pouze 10 mL mléka.

Jak pracuje AGROS ELISA?

Metoda ELISA využívá principu imunosorbce, což znamená imobilizaci jedné ze složek imunokomplexu na pevnou fázi. Značený a neznačený progesteron kompetují o omezený počet vazebných míst protilátek sorbovaných na stěnách jamek mikrotitrační desky. Navázané a volné reagencie jsou pak odděleny jednoduchým promytím (obr.č.3). Pokud je množství protilátek konstantní, je množství vázaného značeného progesteronu, tzv. traceru, tím větší, čím menší je množství neznačeného progesteronu ve stanovovaném vzorku a naopak. Pomocí standardů o známé koncentraci lze vyjádřit vztah mezi množstvím neznačeného antigenu v komplexu progesteron-protilátka a barevnou odezvou jamky. Substrát, 3,3,5,5 –tetramethylbenzidine (TMB) je přidán do reakčních jamek po imunoreakci a inkubován 10-15 min. Substrát reaguje s tracerem, který je vázán na protilátku navázanou na stěně jamek za tvorby žlutě zabarveného produktu. Absorbance tohoto zabarvení je nepřímo závislá na množství progesteronu ve vzorku a změří se ve vertikálním spektrofotometru. Vyjádřením tohoto vztahu získáme kalibrační křivku typickou pro imunoanalýzy

 

  

 


 

    

 

 

 

 

 

Pevná fáze s limitovaným                                                                            Směs známého množství značeného

množstvím protilátky                                                                                     a stanoveného antigenu

ěco zajímavého

spolupracujeme

další zajímavosti